Methoden

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Neben klassischer Morphologie und gewebsbasierten Untersuchungsmethoden wie Immunhistologie, Immunfluoreszenz und in-situ-Hybridisierung nutzen wir ein breites Spektrum molekularer Methoden wie Sequenzierung, Mikrosatelliteninstabilitätsuntersuchungen, Durchflusszytometrie (FACS), quantitative PCR, Schmelzkurvenanalytik, Proliferations-, Invasions- und Migrationsassays, siRNA-Techniken sowie alle klassischen Zellkulturmethoden.

Auch Hochdurchsatzmethoden, wie miRNA und mRNA-Arrays sowie metabolic profiling mittels GC-MS werden von uns in einigen Projekten genutzt.

Konventionelle Gewebsfärbungen

Eine Reihe konventioneller Färbemethoden stehen für die Anfärbung von Gefrier- und Paraffinschnittpräparaten zur Verfügen. Darunter fällt beispielsweise die Standard-Diagnostikfärbung mit Hämatoxilin und Eosin (H&E) als auch die häufig verwendete Perjodsäure-Schiff (PAS) Schleimfärbung und eine lange Reihe weiterer Spezialfärbungen. Ziel dieser Färbungen ist es, spezifische Gewebsstrukturen und Elemente einer Erkrankung möglichst prominent darzustellen, um damit die Interpretation von Gewebsalterationen zu erleichtern.

Abb. 1: Mammakarzinom, Brustgewebe, H&E

Abb. 2: Leishmaniose, Dünndarm, H&E


Immunfluoreszenz

Ähnlich wie mit der Immunhistochemie werden mittels Immunfluoreszenz (IF) Proteine in Zellen mit Antikörpern spezifisch detektiert und dargestellt. Die Visualisierung der Antikörperbindung an das Zielmolekül erfolgt hier jedoch nicht durch eine Farbreaktion sondern durch Fluoreszenzfarbstoffe, die Licht einer bestimmten Wellenlänge emittieren (Cy 3 oder Cy5). Diese Lichtsignale lassen sich mit einem Fluoreszenzmikroskop beobachten und mit der Kamera dokumentieren. In unserem Institut steht darüber hinaus ein konfokales Laserscanmikroskop zur Verfügung, das sehr detaillierte Aufnahmen einzelner Ebenen der beobachteten Zellen ermöglicht (siehe nachfolgende Fotografien). Der Einsatz der IF liegt vor allem in der Zellkultur, wenn die genaue subzelluläre Lokalisation von Proteinen untersucht werden muß (nukleär, zytoplasmatisch, membranär). Es können jedoch auch Gewebsschnitte mittels IF untersucht werden.

CD24 im Kolonkarzinom

Diese Bild zeigt einen Gewebsschnitt von einem Kolonkarzinom. Die Immunfuoreszenz (rote Färbung) stellt das Oberflächenmolekül CD24 dar, das in der Zellmembran lokalisiert ist. Aufgrund dessen findet sich in der IF eine membranäre Färbung. Kern und Zytoplasma der Tumorzellen sind ungefärbt (schwarz).

Azetyliertes Histon 3 in CX2-Kolonkarzinomzellen nach Valproatbehandlung

Dieses Foto stellt kultivierte CX-2-Kolonkarzinomzellen dar, die mit dem Histondeazetylase (HDAC)-Inhibitor Valproat behandelt worden sind. Da die Aktivität der HDACs durch Valproat gehemmt worden ist, findet sich in den Zellkernen azetyliertes Histon 3 (gelbes Signal).

p65 in OVCAR-3 Ovarialkarzinomzellen nach IL1-β-Stimulation

Auf dieser Abbildung sind kultivierte OVCAR-3- Ovarialkarzinomzellen zu sehen, die mit Interleukin 1β (IL-1β) behandelt worden sind. IL-1β-Stimulation aktiviert den Transkriptionsfaktor NF-κB, und führt zu seiner Translokation in den Zellkern (p65 ist eine Untereinheit von NF-κB und wird hier durch IF detektiert, gelbes Signal). Das kleine Foto zeigt nicht-stimulierte Zellen, bei denen NF-κB/p65 inaktiv und vorwiegend im Zytoplasma lokalisiert ist.


Molekularpathologie

Sequenzierung

Für viele chemotherapeutische Behandlungsstrategien ist es notwendig, im Vorfeld den Mutationsstatus der Patienten im Tumorgewebe zu untersuchen. Verschiedene Sequenzierungsmethoden können dabei Anwendung finden. Bei der klassischen Sanger-Sequenzierung wird im Labor zunächst die Tumor-DNA aus Gewebeblöcken extrahiert und der DNA-Doppelstrang durch Erhitzen getrennt. Für die anschließende PCR-Reaktion werden spezielle Stopp-Nukleodide verwendet, die jeweils mit unterschiedlichen Farbstoffen markiert sind und den Einbau weiterer Nukleotide verhindern. Auf diese Weise entstehen basenspezifisch terminierte DNA-Fragmente, die in der Kapillarelektrophorese der Größe nach aufgetrennt werden können. Anhand der Abfolge der Fluoreszenzsignale kann anschließend die Sequenz des DNA-Strangs abgelesen werden (Abbildung 1).

Anders als bei der Sanger-Sequenzierung kann bei der Pyrosequenzierung die Sequenzierreaktion "life" verfolgt werden. Nacheinander werden hier einzelne Nukleotide zur laufenden Synthesereaktion gegeben. Wird ein passendes Nukleotid eingebaut, entsteht durch ein spezielles System verschiedener Enzyme ein Lichtblitz. Die Abfolge der Lichtsignale kann anschließend in einem Pyrogramm abgelesen werden. Besonders geeignet ist diese Methode um den Austausch einzelner Basen in einem Genabschnitt nachzuweisen (Abbildung 2).

MSI-Analyse

Mikrosatelliten sind kurze Wiederholungssequenzen in der DNA, deren Länge durch einen Defekt im Mismatch-Repairsystem variieren kann. Besonders häufig findet man eine solche genetische Instabilität in hereditären Dickdarm-Karzinomen (HNPCCs). Eine MSI-Analyse kann daher einen ersten Hinweis auf das Vorliegen eines HNPCC-Syndroms liefern. Für die Untersuchung werden aus einer Gewebeprobe fünf verschiedene Mikrosatelliten mit fluoreszenzmarkierten Primern amplifiziert. Die PCR-Produkte werden anschließend mittels Kapillarelektrophorese aufgetrennt (Fragmentlängenanalyse). Finden sich im allelischen Profil des Tumorgewebes zusätzliche, kürzere Fragmente im Vergleich zum Normalgewebe, deutet dies auf eine Mikrosatelliten-Instabilität hin. 

Ein typisches Bild eines Patienten mit Mikrosatelliten-Instabilität ist in Abbildung 3 zu sehen.

Kapillarelektrophorese/ Sanger-Sequenzierung

Abb. 1: Kapillarelektrophorese/ Sanger-Sequenzierung 

Abb. 2: Pyrogramm einer KRAS-Genotypisierung für Codon 12 und 13.  Oben: Wildtyp; unten: G/A-Basenaustausch in Codon 12

Abb. 3: Elektropherogramm nach MSI-Analyse im Tumorgewebe Blau, grün und schwarz: Mononukleotidmarker; rot: interner Größenstandard 


Virtuelle Mikroskopie

Die virtuelle Mikroskopie beinhaltet das Erstellen von kompletten elektronischen Abbildern mikroskopischer Präparate und deren analog zum Mikroskopieren erfolgende Visualisierung über den Computer (P. Hufnagl, K. Schlüns: Virtuelle Mikroskopie und Routinediagnostik. Ein Diskussionspapier. Pathologe 2008 [Suppl 2] 29:250–254). Mittels eines Slide Scanners werden Objektträger mit histologischen Präparaten gescannt und als Whole Slide Images (WSI) archiviert. Die Auswertung dieser erfolgt mittels einer Software (hier: VM Slide Explorer 2009) am Bildschirm.

Abb. 1: Ansicht des VM Slide Explorers 2009 der VMscope GmbH am Beispiel eines TMAs in der Übersicht. Umrandung der zu untersuchenden Spots zur exakten und schnellen Orientierung ("gridding").

Abb. 2: Ein zu untersuchender Spots auf dem TMA in 20facher Vergrößerung.

Abb. 3: Beispiel einer positiven Färbereaktion (braune Pigmente) mittels Immunhistochemie.